从具有活血破瘀作用的中药干漆中分离纯化两个倍半萜类新化合物,以其为活性成分的药物组合物,其制备方法,以及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的应用。该两个新化合物具有显著的抑制高糖诱导的大鼠肾系膜细胞株分泌IL-6,纤粘连蛋白(Fibronectin)和IV型胶原蛋白的作用,且其呈现明显的量效与时效关系,显示该类化合物在制备抗糖尿病性肾病和慢性肾病药物中的应用前景。
1.具有下述结构式的倍半萜类化合物1和2,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>
2.治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物组合物,含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物1或2和药学上可接受的载体。
3.权利要求1所述的化合物在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物中的应用。
4.制备权利要求1所述的化合物1和2的方法,取干漆,粉碎成粗粉,用80%乙醇室温浸渍3次,每次溶媒20L,合并提取液减压回收溶剂得浸膏,浸膏用水混悬后用等体积乙酸乙酯萃取3次,每次5L,乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂得提取物,该提取物经硅胶200-300目硅胶柱层析,经99:1,98:2,97:3,96:4,95:5,94:6,93:7,92:8,90:10,85:15,80:20氯仿-甲醇系统梯度洗脱,每种溶剂梯度为2倍柱体积,按照每份500mL收集得10个组份;组份5经硅胶100g柱层析,10:1-1:1的石油醚-丙酮梯度洗脱得化合物2;组份7经MCIxa0gelxa0CHP20P柱层析,30–100%甲醇-水洗脱得4个亚组份,其中组份7-1经Sephadexxa0LH-20甲醇柱层析,得化合物1。技术领域:本发明属于药物技术领域,涉及倍半萜衍生物及其以其为活性成分的药物组合物,其制备方法,以及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的应用。背景技术:糖尿病肾病或慢性肾病的危害、病理机制及药物研究的方法和原理,我们在已公开的专利公布号:CN102153630A中均有明确的描述。诚然,现代紧张的生活方式以及饮食方式的改变,致使世界范围内肥胖、糖尿病增多,其进而引起并发症如糖尿病肾病或慢性肾病。鉴于这一疾病领域目前治疗药物缺乏或有限,因此不断寻找干预糖尿病肾病或慢性肾病的药物十分必要。近年的研究进展表明糖尿病肾病和肾病的发生发展是与细胞因子如IL-6,MCP-1等以及细胞外基质如IV型胶原以及纤粘蛋白的过度分泌密切相关。因此观察药物对高糖诱导的肾系膜细胞的细胞因子和胶原蛋白的影响,已经成为目前研究糖尿病肾病药物的常用方法。干漆为漆树(Toxicodendronxa0verniciflum)分泌的树脂干燥后的产物,又名漆渣,自古药用,据不完全统计历代以干漆命名的干漆丸有25个,干漆也是著名经方大黄蛰虫丸的重要组成药味之一,具有活血破瘀作用。糖尿病肾病属于微血管病变,我们推测有可能从活血化(破)瘀中药中寻找到抗糖尿病肾病活性物质,用于糖尿病肾病等慢性肾病的干预。现有技术中未见有本发明的化合物及其具有糖尿病肾病或慢性肾病价值治疗前景的活性的相关报道。发明内容:本发明的目的在于提供具有抗糖尿病肾病或慢性肾病价值的化合物1和2,以其为活性成分的药物组合物,其制备方法,以及其在制备治疗糖尿病性肾病或慢性肾病的药物中的应用。本发明的上述目的是由下述的技术方案得以实现的:具有下述结构式的倍半萜类化合物1和2,ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物组合物,含有治疗有效量的上述化合物1或2和药学上可接受的载体。化合物1或2在制备治疗糖尿病肾病或慢性肾病的药物中的应用。制备所述的化合物1和2的方法,取干漆,粉碎成粗粉,用80%乙醇室温浸渍3次,每次溶媒20L,合并提取液减压回收溶剂得浸膏,浸膏用水混悬后用等体积乙酸乙酯萃取3次,每次5L,乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂得提取物,该提取物经硅胶200-300目硅胶柱层析,经99:1,98:2,97:3,96:4,95:5,94:6,93:7,92:8,90:10,85:15,80:20氯仿-甲醇系统梯度洗脱,每种溶剂梯度为2倍柱体积,按照每份500mL收集得10个组份;组份5经硅胶100g柱层析,10:1-1:1的石油醚-丙酮梯度洗脱得化合物2;组份7经MCIxa0gelxa0CHP20P柱层析,30–100%甲醇-水洗脱得4个亚组份,其中组份7-1经Sephadexxa0LH-20甲醇柱层析,得化合物1。本发明化合物可以单独直接应用或组合应用,也可以与其它药物包括植物提取物组成复方的形式使用,可以使用不同的药用辅料,制成多种固体制剂和液体制剂。将本发明的药物组合物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物可经口服和注射两种形式给药。使用量可根据给药途径、患者的年龄、体重、所治疗疾病的类型和严重程度等变化进行一次或多次使用。附图说明:图1A-1C表示化合物抑制高糖诱导的肾系膜细胞促炎症因子及细胞外基质测定实验:采用USCK公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6,Collagenxa0IV和Fibronectin的表达;图1A为化合物对白细胞介素-6(IL-6)的抑制作用,*P<0.05vs正常糖;^#P<0.05vs高糖;图1B为化合物对纤粘连蛋白(fibronectin)的抑制作用.*P<0.05vs正常糖;^#P<0.05vs高糖;图1C为化合物对IV型胶原的抑制作用.*P<0.05vs正常糖;^#P<0.05vs高糖。图2A-2C表示化合物抑制高糖诱导的肾系膜细胞促炎症因子及细胞外基质的时效关系;图2A为化合物对白细胞介素-6(IL-6)的抑制作用(时效关系);图2B为化合物对纤粘连蛋白(fibronectin)的抑制作用(时效关系);图2C为化合物对IV型胶原的抑制作用(时效关系)。具体实施方式:下面用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容,但并不以此来限定本发明。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明的范围。实施例1:化合物1和2的分离纯化:干漆17kg,粉碎成粗粉,用80%乙醇室温浸渍3次,每次溶媒20L。合并提取液减压回收溶剂得浸膏,浸膏用水混悬后用等体积乙酸乙酯萃取3次,每次5L。乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂得220g提取物,该提取物经硅胶柱层析(硅胶200-300目,2.5kg),氯仿-甲醇系统梯度洗脱(99:1,98:2,97:3,96:4,95:5,94:6,93:7,92:8,90:10,85:15,80:20),每种溶剂梯度为2倍柱体积,按照每份500mL收集)得10个组份。组份5(18.3g)经硅胶柱层析(硅胶100g),石油醚-丙酮(10:1-1:1)梯度洗脱得化合物2(4.2mg);组份7(13.0g)经MCIgelCHP20P柱层析,甲醇-水(30–100%)洗脱得4个亚组份,其中组份7-1(1.1g)经SephadexLH-20(甲醇)柱层析,得化合物1(5.0mg).化合物1和2的结构确证:化合物1和2的结构式如下所示:ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>化合物1和2的结构鉴定数据:Table1¹Hand¹³CNMRxa0dataxa0ofxa01and2(δinxa0ppm,JinHz).ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>^a1Hxa0NMRxa0at400MHz,¹³Cxa0NMRxa0at100MHzxa0inxa0CDCl₃,andxa0thexa0assignmentsxa0werexa0basedxa0onxa0DEPT,2Dxa0NMRxa0experiments.^b1Hxa0NMRxa0at500MHz,¹³Cxa0NMRxa0at100MHzxa0inxa0CDCl₃,andxa0thexa0assignmentsxa0werexa0basedxa0onxa0DEPT,2Dxa0NMRxa0experimentsToxicodenanexa0B(1):colorlessxa0gums;[α]¹⁵_D+7.69(c0.24,CHCl₃);IR(KBr)ν_max3423,2958,2924,2853,1727,1462,1377,1159,1065,1033,968cm^-1;ESIMS(negative):m/z507[2M-H]^-;HRESIMS(negative):m/z253.1802[M-H]^-(calcdxa0forxa0C₁₅H₂₅O₃,253.1803).Toxicodenanexa0C(2):colorlessxa0gums;[α]¹⁵_D–4.9(c0.35,CHCl₃);IR(KBr)ν_max3426,2954,2925,2854,1640,1463,1378,1168,1093,1042,1033,881cm^-1;EIMS:m/z236[M]⁺;HREIMS:m/z236.1778[M]⁺(calcdxa0forxa0C₁₅H₂₄O₂,236.1776).实施例2:实施例1中化合物1或2,按常规法加注射用水,精滤,灌封灭菌后可制成注射液。实施例3:实施例1中化合物1或2,将其溶于无菌注射用水中,用无菌漏斗过滤,分装,低温冷冻干燥后无菌熔封即得粉针剂。实施例4:实施例1中化合物1或2,按常规法配以各种药用辅料可制成片剂。使用实施例1中化合物1或2作为药物活性成分,使用几种赋形剂作为制备组合药物片剂的辅料成分,按照一定比例配比制成每片含有药物成分1-100mg的片剂样品,表1给出普通片剂的配方比例。将一定数量实施例1化合物1或2与赋形剂辅料制备成不同剂量片剂制剂(如表1):将几种赋形剂辅料与原料药均匀混合,加入1%羟甲基纤维素钠溶液适量制成软料,过筛制粒,湿粒烘干并过筛整粒,加入硬脂酸镁和滑石粉混合均匀后压片即得。表1xa0xa0实施例1中化合物1或2组合药物片剂的原料药和辅料配方ntent="drawing" img-format="tif" inline="no" orientation="portrait" wi="700"/>实施例5:实施例1中化合物1或2按常规法配以各种药用辅料可制成胶囊剂:含有实施例1中化合物1或2作为有效成分的药物组合胶囊制剂的制备,使用实施例1中化合物中的任一种作为药物活性成分、使用几种赋形剂作为制备组合药物胶囊剂的辅料成分,按照一定比例配比制成每粒胶囊中含有化合物1或2成分1-100mg的胶囊制剂。实施例6:本发明化合物及其与药用辅料组成的药物组合物的抗糖尿病肾病或慢性肾病的药理作用。化合物1和2抑制肾系膜细胞株炎症因子和细胞外基质测定实验(见图1所示):采用Uscn公司的ELISA试剂盒检测大鼠系膜细胞培养上清IL-6,Collagenxa0IV和Fibronectin表达。图1A为IL-6的化合物剂量依赖性表达;图1B为Fibronectin的化合物剂量依赖性表达;图1C为Collagenxa0IV的化合物剂量依赖性表达。图2A为IL-6的化合物时效关系;图2B为Fibronectin的化合物时效关系;图2C为Collagenxa0IV的化合物时效关系。实验原理:采用双抗体夹心法测定标本中大鼠系膜细胞培养上清IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV表达水平。用纯化的抗IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV抗体包被微孔板,制成固相抗体,向包被单抗的微孔中依次加入含表达IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV的待测样品,再与HRP标记的抗体结合,形成抗体-抗原-酶标抗体复合物,经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV的表达呈正相关。用酶标仪450nm波长下测定吸光度(OD值),通过标准曲线计算样品中大鼠IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV浓度。样本处理:1)细胞培养上清:无菌管收集,2,000rpm/min,离心20min。仔细收集上清。分装冻存于-80°C。2)刮取底壁细胞,总蛋白裂解液裂解,12,000rpm/min,4°C离心10min,收集上清,Bradford法测量总蛋白含量。ELISA检测:操作按试剂盒说明进行:1)标准品的稀释与加样:酶标包被板设标准品孔,倍比稀释(稀释后各孔加样量都为50μl)加入IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV的标准品。2)加样:分别设空白孔(空白对照孔不加样品和酶标试剂,其余各骤操作相同)、待测样品孔(样品稀释度为5倍)。轻轻晃动混匀。3)温育:37°C,30min。4)洗涤:弃去板中液体,甩干,洗液洗5次,30秒/次。吸水纸拍干。5)加酶:每孔加入50μl酶标记液,空白孔除外。6)温育:37°C,30min。7)洗涤:弃去板中液体,甩干,洗液洗5次,30秒/次。吸水纸拍干。8)显色:每孔加入底物A、B液各50μl/孔。37°C,15min。避光。9)终止:每孔加入终止液各50μl/孔。10)测定:以空白孔调零,酶标仪450nm读吸光度(OD值)。11)实验重复3次。结果计算:利用标准品定量曲线分析计算样品浓度并以细胞总蛋白含量校正(IL-6:pg/mgxa0cellxa0protein;Fibronectin&Collagenxa0IV:ng/mgxa0cellxa0protein)。以上结果说明化合物1和2在1,3,10和30μM时对高糖诱导的肾系膜细胞株炎症因子IL-6、Fibronectin及Collagenxa0IV均有剂量依赖性的抑制作用。由于这些细胞因子和细胞外基质在糖尿病肾病和慢性肾病中被检测到且呈现高表达,因此抑制它们的分泌无疑对糖尿病肾病或肾病的防治具有积极的价值。